完美基因组
T2T完美基因组测序
T2T（Telomere-to-telomere）基因组：是指组装的无gap的端粒到端粒的基因组（在rDNA区域、性染色体、着丝粒中可能允许少量gaps）；具有非常高的Q值（准确性）和BUSCO值（完整性）；在原始数据与组装之间具有最小的结构性错误。
应用方向
- 获得完美基因组，抢占研究领域参考级别基因组，为同行研究提供参考。
- 近着丝粒基因研究，为着丝粒区域的遗传信息（结构、功能）等研究提供数据支持。
- 为农艺性状亦或疾病研究提供新的见解。
- 发现未知的重复序列和基因组“暗黑区域”，为医学研究提供新的思路。
测序策略选择
60X HiFi + 100X Ultra-long ONT（N50 > 100K）+ 50X 二代 + 100X Hic
- 60X HiFi数据使用Hifiasm进行组装，得到HiFi contig，较常规组装（30X）深度更高，可得到完整性、连续性更高的contig骨架基因组，同时还可为单体型-T2T提供深度支持，进行单体型-T2T组装；
- 100X Ultra-long ONT（N50 > 100K）数据使用Nextdenovo进行组装，并使用50X Illumina数据进行纠错，得到ONT contig，使用Ultra-long ONT组装目的是得到片段超长的contig基因组；
- 100X Hic数据经Hicup质控，对Hifi contig及ONT contig两版基因组进行Allhic挂载得到基因组染色体版本；
- 以HiFi 染色体级别基因组作为Reference，将Ultra-long ONT染色体级别基因组与其进行相互Merge，最终得到T2T级别基因组。
T2T基因组质量评估
T2T基因组组装完成后，需要进行以下评估内容：
- 基因组评估：包含BUSCO评估（>95%）、序列一致性评估(>98%)、QV评估（>45）等。
- 与该物种发表最佳版本基因组进行共线性评估：Mummer。
- 着丝粒、端粒鉴定：对着丝粒、端粒进行预测，若研究较成熟物种（序列已知），将其与基因组直接比对查验。例如：人类端粒（TTAGGG）、拟南芥端粒（TTTAGGG）。
- 着丝粒也可使用Chip-seq、FISH等实验进行验证。
- 填补Gap区域可使用PCR实验进行验证。
适用物种推荐
动物：哺乳动物、淡水鱼类（详细评估）、海洋动物（先评估）。
植物：3G以内常规物种，如芝麻、玉米、大豆、棉花等。
特殊物种：部分异源多倍体物种（棉花、油菜等）。
常见问题
基因组的组装难易程度主要由哪些方面影响？
①基因组大小。基因组越大，对应的重复序列往往越丰富，导致拼接的难度越高；②杂合度与重复序列比例。相同大小的基因组下，杂合度和重复比例越高，基因组组装的连续性和完整性会越低（高杂合的基因组往往无法合并姊妹染色体，导致组装的结果偏大，杂合位点容易拼接断裂使得连续性降低，而重复序列在组装中会被折叠，使组装中出现缺口、错误，导致组装的结果偏小）。因此通常会需要适当增加测序深度以覆盖这些复杂的区域。③基因组的倍性和倍型。难易程度由易至难分别为：二倍体＞异源多倍体＞同源多倍体。
如何知道物种基因组大小？
①已发表过基因组的可通过NCBI网站查询：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/②未发表基因组的通过流式网站查询：植物–https://cvalues.science.kew.org/ ；动物：http://www.genomesize.com/③进行流式、survey（调研图）进行分析
基因组Survey是什么？可否不进行？
①基因组Survey以二代测序技术为基础，基于小片段文库进行低深度测序，通过K-mer分析，快速获得基因组大小、杂合度、重复序列比例等基本信息的研究方法。为制定该物种的全基因组de novo测序策略提供有效依据。②基因组survey的二代数据具有纠错和评估的重要作用，除非是已知基因组大小的单倍体等背景较为清晰的物种情况下，通过HiFi模式组装，并且不需要做二代数据评估，可以考虑不进行，否则建议为必须进行。
为什么三代测序样品要与二代survey测序样品来自同一个个体？
①不同个体间会存在一定差异，若选材差异大可能会影响到三代测序策略的制定②二代数据需为Nanopore/Pacbio CLR模式基因组进行纠错，避免因个体间序列差异影响纠错效果③二代数据需回比组装完成的基因组来评估该基因组组装的完整性，避免因个体间序列差异降低比对率。
为什么要进行全基因组测序？
基因组表示的是一个物种内全部的遗传信息，没有参考基因组使得关键基因无法被挖掘，调控机理难以被解析，成为科研的掣肘。而早期构建的参考基因组质量往往较差，导致①组装不完整，可能遗失相当多的基因片段，想要的基因因为未被组装到而被错失。②连续性较差，短片段较多，且不利于研究由较长片段形成的与功能相关的基因。③拼接准确性有偏差，较短的片段在拼接时易因序列重复导致排序错误，从而影响后续相关研究的顺利进行。甚者，所研究品种与已发表参考不同使得研究受到阻碍①相同的种下不同的品种/品系/变种比对率低，可用数据少；②雌雄性别差异，公布只有单个性别，找不到性别相关区域。
是否必须等Survey分析完之后才能启动三代测序？
针对已知倍型倍性、已明确基因组大小（通过流式等方式）或已经发表过同品种、近缘种材料的项目，可以同时启动survey与三代测序，节约时间成本，使项目更快的推进。
若物种背景尚不完全明晰，需要先完成survey，再开展三代测序组装。基于该物种基因组的大小、杂合及重复序列比例来制定合适的三代测序深度与数据量。
哪些参数可以评估构建的基因组？
①基因组大小及连续性（N50）：基因组组装大小与调研图一致、N50值越高越好。（通常contigN50值≥1Mb即可满足绝大多数分析需求）②二代回比率：将二代高通量测序得到的短序列与组装得到的基因组比对，通过统计比对率，可评估组装基因组的完整性。③Busco/Cegma等数据库评估：在组装得到的基因组上查找软件数据库中的保守基因，通过找到的保守基因比例，评估基因组上基因组装的完整性。④LAI评估，鉴定完整LTR-RTs占比。
基因组做完之后可以开展什么研究？
基因组完成后可以进行比较基因组学分析，与近缘物种进行宏观进化研究，其内容主要包括：(1) 基因家族聚类，分析特有、共有基因和基因家族；(2) 基因家族扩张收缩分析；(3) 系统发育树的构建；(4) 物种分化时间推算；(5)LTR形成时间估算（一般为植物基因组的分析项）；(6)全基因组复制事件（一般为植物基因组的分析项）；(7)选择压力分析；(8)共线性分析。具体可见涨知识啦！比较基因组学研究那些事
允思拓服务